Το μουσείο άνοιξε για το κοινό το 2004 για να στεγάσει τη συλλογή που δημιουργήθηκε αρχικά από τον Αντώνη Μπενάκη, την εποχή που ζούσε ακόμα στην Αίγυπτο και συνέχισε μετά την εγκατάστασή του στην Αθήνα. Μετέπειτα εμπλουτίστηκε με άλλες δωρεές και σήμερα το μουσείο κατέχει μια από τις σημαντικότερες συλλογές διεθνώς. Η ιδιαιτερότητα των αντικειμένων αυτών έγκειται τόσο στην ιστορική σημασία όσο και στην δεξιοτεχνική κατασκευή τους.
Η συλλογή προϊστορικών, αρχαίων ελληνικών και ρωμαϊκών αρχαιοτήτων, η οποία συγκροτήθηκε χάρη στη συμβολή πολλών Ελλήνων και ξένων δωρητών, αλλά και σε παρακαταθήκες μουσείων, καλύπτει ένα ευρύ χρονικό φάσμα από την αυγή της προϊστορίας έως το τέλος της ρωμαϊκής περιόδου.
Η Βυζαντινή Συλλογή του Μουσείου Μπενάκη αποτελεί το συνδετικό κρίκο των ενοτήτων που εικονογραφούν το πέρασμα από τον Ελληνισμό της αρχαιότητας στο νεότερο Ελληνισμό. Η συλλογή, χωρίς να καλύπτει όλες τις τάσεις και τα ρεύματα που αναπτύχθηκαν στη χιλιόχρονη πορεία του Βυζαντίου, διαθέτει ωστόσο εξαιρετική ποικιλία και χωρίζεται σε δύο ενότητες.
Η συλλογή των ιστορικών κειμηλίων ανασυνθέτει τον ιστορικό και πνευματικό βίο της νεότερης Ελλάδας από τα τέλη του 18ου αιώνα και εξής.
Μεγάλο τμήμα της συλλογής αποτελούν οι δωρεές οικογενειακών κειμηλίων από τους απογόνους και συγγενείς των προσώπων που συνδέθηκαν με τις νεότερες εμπειρίες του ελληνικού χώρου.
Η Συλλογή αυτή είναι κατά το μεγαλύτερο μέρος της δωρεά του Γεωργίου Ευμορφόπουλου, ενός από τους σημαντικότερους συλλέκτες και μελετητές του κινέζικου πολιτισμού.
Η Κοπτική Συλλογή του Μουσείου περιλαμβάνει μια μοναδική και πλουσιότατη ομάδα υφασμάτων, που πρόσφατα προβλήθηκε διεθνώς μέσω του ευρωπαϊκού προγράμματος Tissus. Στα υφάσματα της Συλλογής εκφράζεται με τον καλύτερο τρόπο ο συγκερασμός στοιχείων από την τοπική αιγυπτιακή παράδοση και τον ελληνορωμαϊκό πολιτισμό, με δυναμικά νεοτερικά στοιχεία της χριστιανικής θρησκείας.
Οι συλλογές της εκκλησιαστικής και της κοσμικής τέχνης καλύπτουν χρονικά την ιστορική περίοδο από το 15ο ως το 19ο αιώνα, τεκμηριώνοντας τον υψηλό πολιτιστικό δείκτη του νεοελληνικού κόσμου κατά τη διάρκεια της Φραγκοκρατίας και της Οθωμανικής κατοχής.
Τον πυρήνα της Συλλογής αποτελούν έργα από την προσωπική συλλογή του Αντώνη Μπενάκη, ενώ ο κορμός της συγκροτήθηκε κατά μεγάλο μέρος από τη δωρεά του Δαμιανού Κυριαζή (1953) και εμπλουτίστηκε με δωρεές και κληροδοτήματα πολλών άλλων φίλων του Μουσείου. Περιλαμβάνει συνολικά 6.000 περίπου έργα ζωγραφικής και χαρακτικής κατά κύριο λόγο Ευρωπαίων καλλιτεχνών από τον 17ο ως τον 19ο αι., καθώς και έργα Ελλήνων ζωγράφων του 19ου και 20ού αι.
Η Πινακοθήκη Ν. Χατζηκυριάκου-Γκίκα αποτελεί δωρεά του μεγάλου έλληνα ζωγράφου στο Μουσείο Μπενάκη, ως παράρτημα του οποίου λειτούργησε από το 1991 έως το 2000, οπότε και έκλεισε προσωρινά λόγω εργασιών για τη συντήρηση και ανάπλαση του κτηρίου. Οι εργασίες ξεκίνησαν το 2005 από τον αρχιτέκτονα Παύλο Καλλιγά και το Μάιο του 2012 η Πινακοθήκη ξανάνοιξε τις πύλες της στο κοινό.
O μεγάλος Έλληνας δημιουργός Γιάννης Παππάς (1913-2005) ανακοίνωσε τον Απρίλιο του 2002 ότι το σύνολο των έργων που βρίσκονται συγκεντρωμένα στο εργαστήριό του περιέρχεται στο Μουσείο Μπενάκη. Η δωρεά αυτή καλύπτει το μεγαλύτερο μέρος της καλλιτεχνικής παραγωγής του καλλιτέχνη από το 1930 μέχρι σήμερα.
Πυρήνα του Τμήματος Παιχνιδιών, το οποίο ιδρύθηκε το 1991, αποτελεί η δωρεά της Μαρίας Αργυριάδη.
Στις συλλογές του περιλαμβάνονται 20.000 παιχνίδια και αντικείμενα της παιδικής ηλικίας, προερχόμενα από τον ελλαδικό χώρο και την ευρύτερη περιφέρεια του Ελληνισμού – από την αρχαιότητα μέχρι το 1970 – καθώς και από την Ευρώπη, την Αμερική, την Αφρική και από χώρες της Ανατολής.
Η Συλλογή Προκολομβιανής τέχνης αποτελεί δωρεά του Γεωργίου Γόντικα και περιλαμβάνει αντικείμενα που ανήκουν στους λεγόμενους «Πολιτισμούς των Άνδεων» της Νοτίου Αμερικής. Με τον γενικό όρο «Πολιτισμοί των Άνδεων» δηλώνονται οι πολλές πολιτισμικές ομάδες που ζούσαν στην οροσειρά των Άνδεων και είχαν κοινή λατρεία και τεχνολογία. Η εκτεταμένη αυτή περιοχή διακρίνεται σε τρείς ζώνες: τις Βόρειες Άνδεις (Κολομβία, Ισημερινός και ενα μικρό τμήμα του Περού), τις κεντρικές Άνδεις (τα υψηλά οροπέδια του Περού και της Βολιβίας) και προς νότον, την έρημο της Χιλής.